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    分子克隆實(shí)驗(yàn)---第三章：測序結(jié)果解讀

    發(fā)布時間： 2025-03-31　　點(diǎn)擊次數(shù)： 75次

    一代測序是克隆實(shí)驗(yàn)中常見的下游實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)代 DNA 測序技術(shù)源于 Sanger 鏈末端終止測序法，其工作原理與 Sanger 測序不同的是 4 組反應(yīng)的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標(biāo)記，每個試管的產(chǎn)物在光激發(fā)下發(fā)出不同顏色的熒光，延伸反應(yīng)和鏈終止完成后，將全部 4 組反應(yīng)物混合，在同一泳道進(jìn)行凝膠電泳，通過激光束激發(fā)熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測序分析。


    一般情況下，測序信號文件多為 *.ab1 文件，該文件能夠得到每個堿基的測序峰型及整體質(zhì)量；*.seq 文件則為 ab1 文件導(dǎo)出得到的測序結(jié)果序列，ab1 文件中已具有堿基序列信息，因此 *.seq 文件可不作重點(diǎn)關(guān)注。


    一代測序的每次測序反應(yīng)能夠產(chǎn)生約 600-900bp 堿基信息，測序開始的 5’ 端約 50bp 左右的測序信號不穩(wěn)定，檢測 800bp 左右之后信號開始衰減，各種波之間有重疊等情況。這部分結(jié)果信息不準(zhǔn)確，不建議參考使用。

    理想狀態(tài)的測序信號應(yīng)當(dāng)是獨(dú)立單一的峰形信號，波峰與波谷清晰，峰與峰之間的距離均勻，波峰底部沒有雜峰干擾，此時得到的堿基信息可信度超高；測序信號出現(xiàn)雙峰、套峰等情況時，該處堿基信息可信度低，需要其他測序結(jié)果共同比對分析



           

    測序問題的主要原因：
    ◆ 套峰
    a) 全雙峰：多引物結(jié)合位點(diǎn)（菌液、質(zhì)粒）；非特異擴(kuò)增（PCR 產(chǎn)物）；
    b) 前雙峰：多引物結(jié)合位點(diǎn)，其中一套模板測序中斷（菌液、質(zhì)粒）；多引物結(jié)合位點(diǎn)（PCR
    擴(kuò)增未純化產(chǎn)物）；引物二聚體或小片段干擾（PCR 產(chǎn)物純化非切膠樣品）；
    c) 中間雙峰：非單克?。ň骸①|(zhì)粒）；堿基缺失或等位基因雙模板（PCR 擴(kuò)增未純化產(chǎn)物）；
    d) 后雙峰：非單克隆（菌液、質(zhì)粒）；堿基缺失（PCR 產(chǎn)物）。


    ◆ 測序信號

    a) 無信號：引物結(jié)合位點(diǎn)不存在或被破壞；
    b) 信號差：引物或模板的質(zhì)量不高，或引物和模板匹配性低，或樣本濃度偏低；
    c) 信號衰減：可能因測序序列的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致，如 Poly 結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列、回文結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、GC 富集、AT 富集等；若為正常峰形后逐漸衰減，可能模板反應(yīng)量不足；
    d) 信號中斷：模板存在高級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致 dNTP 和 ddNTP 在某位點(diǎn)無法與模板結(jié)合；
    e) 測序移碼：測序開端移碼可能是引物降解，局部移碼可能樣本存在高級結(jié)構(gòu)；

    f) 測序底峰干擾：可能測序引物不純；可能測序樣品不純混有正、反向引物。


    優(yōu)化方案：套峰

    二聚體、小片段干擾：凝膠電泳，切膠純化回收；                                                          
    多引物結(jié)合位點(diǎn)：更換引物測序或反向測通；
    堿基缺失：構(gòu)建單克隆后測序；
    非單克隆：在載體構(gòu)建克隆正確下重新挑取單克隆測序；
    非特異性擴(kuò)增：優(yōu)化反應(yīng)條件重新制備；

    等位基因雙模板：構(gòu)建單克隆后測序。


    測序信號

    無信號：更換引物或重新提供樣品測序；
    信號差：提供高質(zhì)量樣品測序；
    信號衰減：特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致衰減，建議反向測序拼接；若正常峰形后逐漸衰減：提供高質(zhì)量樣品；
    測序中斷：建議反向測序測通；
    測序底峰干擾：重新制備模板，引物 PAGE 膠純化。


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